酶聯(lián)免疫實驗常見問題因靈敏度高，特異性強在生物科研上得到了廣泛的認可，但對初學(xué)者而言，如不注意實驗操作過程中的各個環(huán)節(jié)，可能會對終的實驗結(jié)果產(chǎn)生比較大的影響，比如實驗出現(xiàn)白板，顯色弱靈敏度低，花板無梯度背景高等現(xiàn)象。下面對以上實驗現(xiàn)象進行一一解析。
1.白板現(xiàn)象
在完成所有實驗步驟進行底物TMB溶液顯色后，酶標板中所有孔的顏色均為無色，即無信號呈現(xiàn)。
出現(xiàn)該現(xiàn)象的可能原因：
試劑已過保質(zhì)期，不同批次稀釋液交叉使用。
錯加漏加檢測A，檢測B或者底物溶液TMB。
洗板或者加樣過程中，酶標記物被污染失活，稀釋液中含有酶抑制劑如疊氮吶等。
配置稀釋液的蒸餾水可能被污染。
洗滌液是濃縮型的，沒有按比例進行稀釋。
酶標記物的活性和效價比較低。
溶液的PH值不正確，一般稀釋液的PH值應(yīng)保持在7.2-7.4。
2.顯色弱靈敏度低
在完成所有實驗步驟進行底物TMB溶液顯色后，酶標板中孔的顯色比較淺，即只有微弱的信號呈現(xiàn)。
出現(xiàn)該現(xiàn)象的可能原因：
產(chǎn)品過有效期，試劑沒有按規(guī)定進行適當?shù)谋４妗?/span>
試劑，標準品或者樣品在使用前沒有平衡到室溫。
少加了試劑的量或者加入試劑的稀釋比例不當。
洗板或者加樣過程中，酶標物受污染失活。
孵育時間和孵育溫度未達到實驗要求。
洗滌液稀釋倍數(shù)不符合要求，洗板次數(shù)過多，洗板沖擊力過大，洗板浸泡時間過長。
底物溶液TMB顯色時間太短。
3.花板無梯度背景高
在完成所有實驗步驟進行底物TMB溶液顯色后，酶標板中的孔有顏色但沒有梯度，背景也可能較高，。
出現(xiàn)該現(xiàn)象的可能原因：
底物溶液TMB未置于陰涼避光處保存，實驗前溶液已經(jīng)變藍。
孵育溫度過高或者孵育時間過長，發(fā)生了較強的非特異性吸附。
沒有按說明書要求洗板，特別是洗板時洗滌液的量少加了。
加樣時沒有換槍頭造成交叉污染。
花板現(xiàn)象：低濃度或者低活性的包被抗體或者檢測抗體，封閉不足導(dǎo)致的本底不穩(wěn)定，洗板不充分，包被板子的問題。
綜上所述：在ELISA實驗中應(yīng)注意以下問題：
1.在實驗前應(yīng)該按相關(guān)要求將實驗試劑平衡至室溫。
2.包被抗體和檢測抗體應(yīng)該是有高活性的且都針對同一抗原。
3.試劑保存：蛋白抗體類試劑保存于-20攝氏度，顯色液洗滌液保存于2-8攝氏度。
4.各試劑在使用前應(yīng)充分混勻，以保證試劑的均一性和準確性。
5.嚴格控制反應(yīng)溫度和反應(yīng)試劑。
6.洗板次數(shù)，洗板液的量，洗板液浸泡時間的長短，洗板的力度都是應(yīng)該注意的問題。
7.相關(guān)濃縮液應(yīng)按要求稀釋到相應(yīng)比例方可使用，PH值要保持在7.2-7.4之間。
8.在終止反應(yīng)時盡量避免微孔中存有氣泡。
9.終止反應(yīng)完成后應(yīng)該在2min內(nèi)完成酶標儀讀數(shù)。
